Методы генетики. Медицинская биология Цитогенетический метод в диагностике наследственных болезней человека
Омская Государственная Медицинская Академия
Кафедра пропедевтики детских болезней и поликлинической педиатрии
Утверждаю:
Зав. кафедрой Лукьянов А.В.
“_____” 20__ г.
Медицинская генетика
Методы медицинской генетики – цитогенетический
ОМСК – 2001
УТВЕРЖДАЮ
Зав. кафедрой
“___” 20___ г.
МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА к практическому занятию для студентов IV курса педиатрического факультета
Тема занятия : Методы медицинской генетики – Цитогенетический
Актуальность темы : Значительная часть множественных врожденных пороков развития, нарушений полового и психомоторного развития у детей связана с изменениями числа или структуры хромосом. Успехи в выделении самостоятельных хромосомных синдромов, в их диагностике в каждом конкретном случае, а также профилактике и лечении невозможны без изучения структуры и функций хромосом, основных методов их исследования.
Цель занятия : Изучить строение и классификацию хромосом человека, основные методы исследования – кариотипирование и анализ полового хроматина. Определить основные синдромы, причиной которых являются хромосомные аномалии и показания для цитогенетического метода исследования.
Студент должен знать:
Строение, функцию и классификацию хромосом человека (биология).
Числовые и структурные аномалии хромосом.
Полиморфизм хромосомных синдромов (патофизиология).
Методы цитогенетического исследования (биология).
Студент должен уметь:
Выявить фенотипические признаки хромосомных синдромов у детей.
Определить показания для исследования кариотипа и полового хроматина.
Интерпретировать заключения врача–цитогенетика о наличии хромосомной патологии у пробанда.
Оснащение занятия :
таблицы, слайды, фотографии, ситуационные задачи, препараты метафазных пластинок хромосом человека, препараты буккального эпителия, наборы реактивов, световой микроскоп.
Продолжительность занятия : 140 минут
Место проведения занятия : учебная комната, цитогенетическая лаборатория
Методика проведения занятия :
1. Проверка присутствующих 10 мин
2. Формулировка темы 10 мин
3. Решение ситуационных задач 30 мин
4. Обсуждение материала 65 мин
5. Ответы на вопросы 10 мин
6. Заключение преподавателя и задание на дом 10 мин
Реферат
Цитогенетика человека занимает одно из важнейших мест в медицинской генетике. Объектом цитогенетических исследований служа хромосомы (греч. chroma – ‘цвет’ и soma – ‘тело’; В. Вальдеер, 1888 г) – структурные элементы ядра клетки, заключающие в себе основную часть наследственной информации. В зависимости от функциональной активности и стадии клеточного цикла в составе хромосом ДНК может быть уложена с различной плотностью. События, развертывающиеся в клетке в процессе митотического деления протекают в закономерной последовательности и составляют пять сменяющихся стадий: интерфаза, профаза, метафаза, анафаза и телофаза. Митотические хромосомы образуются в клетке во время митоза, ДНК в них уложена чрезвычайно плотно. Благодаря этому обеспечивается равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками при митозе. Интерфазные хромосомы (хроматин) активно участвуют в процессах транскрипции и репликации.
Форма метафазных хромосом определяется положение первичной перетяжки – центромеры, которая делит ее на две равных или неравных по длине плеча – теломеры. Короткое плеча хромосомы обозначают литерой "p ", длинное – "q ". Выделяют метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы.
Соматические клетки человека имеют постоянный двойной диплоидный (2n ) набор хромосом или кариотип, который составлен из двух одинарных гаплоидных наборов (n ), полученных от родителей. В соматических клетках человека диплоидный набор составляют 46 хромосом (22 пары аутосом и пара половых хромосом). Нормальный набор половых хромосом у женщин представлен ХХ и у мужчин – XY хромосомами. В половых клетках содержится гаплоидный набор хромосом.
Классификация равномерно окрашенных хромосом выработана на международных совещаниях в Денвере (1960), Лондоне (1963) и Чикаго (1966). Хромосомы располагаются в порядке уменьшения их длины. Все пары аутосом нумеруют арабскими цифрами от 1 до 22. Половые хромосомы обозначают латинскими буквами X и Y и при кариотипировании помещают в конце раскладки. Расположенные в указанном порядке, все аутосомы распределяются на семь групп, которые различаются между собой по длине и форме составляющих их членов и обозначаются буквами английского алфавита от A до G. В группе A (1–3) оказываются три пары самых крупных хромосом: 1, 3 – метацентрические хромосомы и 2 – субметацентрическая. Группа B (4–5) включает 2 пары длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6–12) объединяет семь пар субметацентрических аутосом и не отличающуюся от них Х‑хромосому. В группу D (13–15) входят три пары акроцентрических хромосом, а в группу Е (16–18) – три пары субметацентрических хромосом. Группа F (19–20) содержит две пары маленьких метацентрических хромосом, группа G (21–22) – две пары самых мелких акроцентрических хромосом. Y‑хромосома выделяется как самостоятельная.
С появлением методов дифференциальной окраски (G, Q, C) появилась возможность идентифицировать хромосомы по характерному для каждой пары чередованию светлых (эухроматин) и темных (гетерохроматин) полос, расположенных симметрично в сестринских хроматидах (Париж, 1971).
Каждая хромосома дифференцирована на 2 типа различных районов, так называемые эу- и гетерохроматические районы. Эухроматические, активные районы – содержат весь основной комплекс генов ядра, т.е. участков хромосомной нити, дифференциально контролирующих развитие признаков организма. Гетерохроматические районы образуют дистальные и проксимальные участки хромосомной нити, а также входят в состав внутренних ее частей. Роль гетерохроматических районов хромосом, эволюционно закрепленных в их структуре, в настоящее время активно изучается.
Среди геномных мутаций выделяют:
полиплоидии – увеличение количества хромосом, кратное гаплоидному числу n (3n, 4n и т.д. );
анеуплоидии – отклонение количества хромосом от эуплоидных чисел. Среди анеуплоидий выделяют:
моносомии (2n–1 ) – отсутствие одной хромосомы для соответствующей пары,
трисомии (2n+1 ) – наличие 3‑х гомологичных хромосом вместо обычной пары;
мозаицизм – присутствие более одной популяции клеток с разным числом хромосом у одного и того же человека.
Структурные перестройки могут быть сбалансированными , когда порядок расположения сегментов в хромосомах нарушен, но в целом, количества генетического материала не меняется:
инверсии –поворот участка хромосомы на 180°,
транслокации – обмен участками хромосом; могут быть реципрокными при взаимном обмене участками между двумя негомологичными хромосомами и робертсоновскими – транслокации между двумя акроцентрическими хромосомами.
Несбалансированные перестройки возникают при утрате или избытке хромосомного материала:
делеции – утрата части хромосомы;
дупликации – удвоение участка хромосомы;
изохромосомы – хромосомы, состоящие из двух коротких плечей.
Увеличение или потерю хромосомного материала обозначают соответственно знаком "+" или "–", помещаемым перед номером хромосомы (47 ,XY +21 ).
Методы цитогенетического анализа делятся на прямые и непрямые. Непрямые методы включают в качестве обязательного этапа культивирование клеток в искусственных питательных средах. Материалом являются лимфоциты периферической крови и пуповинной крови плода, фибробласты кожи и амниотической жидкости, клетки спонтанно абортируемых эмбрионов и зародышевых оболочек. Прямые методы применяются в тех случаях, когда необходим быстрый результат и имеется возможность получить препараты хромосом клеток, делящихся в организме. Источником таких клеток является костный мозг и клетки зародышевых оболочек. Основным объектом цитогенетического исследования прямыми и непрямыми методами являются стадия метафазы митоза и различные стадии мейоза. Метафаза митоза служит основным объектом для анализа хромосомного набора, т.к. именно на этой стадии возможна точная идентификация хромосом и выявление их аномалий.
Во время митоза каждая хромосома состоит из двух одинаково длинных тонких тяжей, называемых сестринскими хроматидами, сжимающихся в плотные структуры, в связи с чем создается впечатление коротких плечей, поддерживающихся вместе с помощью центромеры. В метафазе, когда их длина самая наибольшая, хромосомы разбиваются на пары. Подобная систематизация хромосом из одной клетки называется кариотипом. При лабораторных исследованиях у каждого пациента анализируется 10–40 метафазных кариотипов. При подозрении на мозаицизм необходимо анализировать как большее число клеток, так и клетки других тканей.
Показания для исследования кариотипа пробанда
Множественные врожденные пороки развития и микроаномалии у новорожденных детей и их родителей.
Олигофрения, задержка физического и нервно-психического развития в сочетании с врожденными аномалиями.
Нарушение дифференцировки пола.
Первичная и вторичная аменорея.
Бесплодие.
Женщины со спонтанными абортами, привычными самопроизвольными абортами, мертворождением.
У родственников пробанда первой степени родства, который имеет структурные перестройки хромосом.
Для выявления изменений в системе половых хромосом используются следующие экспресс–методы :
Определение полового Х‑хроматина в интерфазных ядрах клеток буккального эпителия. Каждая клетка содержит только одну генетически активную Х‑хромосому. Цитологическим проявлением неактивной Х‑хромосомы служит хроматиновая масса (тельце Барра), обнаруживаемая на периферии интерфазного ядра. По количеству телец Барра можно судить о количестве неактивных Х‑хромосом. Например, в используемых клетках женского организма (46,ХХ ), при синдроме Клайнфельтера определяется 1 тельце Барра. В клетках мужского организма и в большинстве эпителиальных клеток при синдроме Тернера (45,Х0 ) половой Х‑хроматин отсутствует. Существует эмпирическое правило, согласно которому число телец полового хроматина равно числу Х‑хромосом минус 1 (В=Х–1 ).
Определение Y ‑хроматина . В интерфазном ядре при окраске люминесцентными красителями (Q–метод) Y‑хромосома выглядит ярко флюоресцирующим скоплением хроматина. Пробы на Х- и Y‑хроматин не должны служить в качестве абсолютно достоверных для диагностики при патологическом изменении половых хромосом. Окончательный ответ может быть получен только при анализе кариотипа пациента.
Показания для исследования полового хроматина
Нарушение половой дифференцировки.
Подозрение на синдромы Шерешевского–Тернера, Клайнфельтера.
Аменорея.
Бесплодие.
Внутриутробное определение пола при Х–сцепленных заболеваниях.
Клинический полиморфизм хромосомных синдромов обусловлен различными аномалиями аутосом и половых хромосом. При хромосомных синдромах отмечается резкий дисбаланс генов, но общее влияние генома создает полиморфизм клинических признаков.
Особенности проявления аутосомной патологии
Характеризуется множественными врожденными пороками развития.
Сопровождается грубым дефектом интеллекта или резкой задержкой психомоторного развития.
Продолжительность жизни больных не значительна.
Диагностика данной патологии возможна с рождения.
Среди числовых аномалий аутосом возможно рождение детей с трисомией 21 хромосомы (синдром Дауна), 13 хромосомы (синдром Патау), 18 хромосомы (синдром Эдвардса), реже встречаются трисомии 8 и 9 хромосом. Трисомия по группам А и В хромосом среди живорожденных не описана.
Среди несбалансированных структурных аномалий возможно рождение детей с синдромами частичной моносомии, например синдром кошачьего крика (делеция короткого плеча 5 хромосомы), синдром Вольфа–Хиршкорна (делеция короткого плеча 4 хромосомы), синдром Арбели (делеция короткого плеча 13 хромосомы), синдром Лежена (делеция короткого плеча 18 хромосомы). Случаем частичной моносомии являются кольцевые хромосомы. Возможна частичная трисомия 6–11 хромосом.
Особенности проявления патологии половых хромосом
Характерно изолированное поражение внутренних органов и микроаномалии.
Интеллект снижен незначительно.
Продолжительность жизни обычная.
Среди числовых аномалий половых хромосом с наибольшей частотой встречаются моносомия Х‑хромосомы (45,Х0 – типичная форма синдрома Шерешевского–Тернера), трисомия Х‑хромосомы у женщин (47,ХХХ ) и дисомия у мужчин (47, XXY – синдром Клайнфельтера), возможна дисомия Y‑хромосомы (47, XYY ).
Из структурных аномалий возможно обнаружение в кариотипе Х‑изохромосомы, состоящей из двух длинных плеч (46, Xi (Xq )), делеции Х‑хромосомы (46, Xdel (X ) (q11 )), кольцевых Х‑хромосом (46, Х , r (Х )).
В большинстве случаев хромосомные аномалии носят спорадический характер, т.е. возникают в виде новой мутации при нормальном кариотипе обоих родителей пробанда. В таких случаях риск для сибсов оценивается по эмпирическим данным для каждого типа аномалий с учетом возраста матери. Риск выше при носительстве сбалансированной перестройки у матери, чем у отца. В ряде случаев при обследовании родителей пробанда у кого-либо из них обнаруживается мозаицизм, т.е. часть клеток имеет такой же аномальный кариотип, как у пробанда. Риск для сибсов рассчитывается по формуле:
|
х |
×К |
|
2–х |
В настоящее время существуют различные схемы лечения целого ряда хромосомных синдромов, включающие гормональную терапию и хирургическую коррекцию дефектов. Важным для профилактики рождения детей с хромосомными синдромами является генетическое консультирование семьи, исследование кариотипа родителей, расчет риска повторного рождения ребенка с хромосомной патологией, использование комплекса прямых методов пренатальной диагностики (ультразвуковое сканирование плода, исследование альфа–фетопротеина, амниоцентез, хорионбиопсия, кордоцентез и др.) для решения вопроса о целесообразности сохранения заведомо неперспективной беременности.
Частота фенотипических признаков при синдроме Шерешевского–Тернера к периоду полового созревания (регулярная и мозаичные формы)
|
Признаки |
Частота (%) |
|
1. Низкий рост |
|
|
2. "Щитовидная" грудная клетка |
|
|
3. Широко расставленные соски |
|
|
4. Деформация тела грудины |
|
|
5. Тестоватый тургор тканей |
|
|
6. Антимонголоидный разрез глаз |
|
|
7. Эпикант |
|
|
8. Деформация ушных раковин |
|
|
9. Крыловидная складка на шее |
|
|
10. Лимфатические отеки |
|
|
11. Олигофрения |
|
|
12. Первичная аменорея |
|
|
13. Сахарный диабет |
|
|
14. Обилие пигментных пятен |
|
|
16. Аркообразное небо |
|
|
17. Низкий рост волос на шее |
|
|
18. Гипоплазия или аномальное строение наружных гениталий |
|
|
19. Врожденные аномалии мочевыводящей системы |
|
|
20. Врожденные пороки сердца |
|
|
21. Аномалии скелета |
Метод позволяет идентифицировать кариотип (особенность строения и число хромосом), путем записи кариограммы. Цитогенетическое исследование проводится у пробанда, его родителей, родственников или плода при подозрении на хромосомный синдром либо другое хромосомное нарушение.
Для определения кариотипа используют как прямые, так и непрямые методы исследования. В первом случае материал, взятый из костного мозга, лимфатических узлов, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости или других тканей, изучают сразу же после получения. Однако прямой метод информативен только тогда, когда в материале имеется достаточное количество метафаз митоза, так как только в этой фазе хромосомы приобретают присущие им особенности строения и возможна их точная идентификация. В настоящее время широко применяются непрямые методы исследования.
Метод приготовления метафазных пластин. Взятую культуру (лимфоциты периферической крови и др.) помещают в питательную среду для культивирования. В норме в периферической крови не наблюдается митоза лимфоцитов, поэтому используют препараты (фитогемагглютинин), стимулирующие иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Вторым этапом является остановка митотического деления клетки на стадии метафазы. Достигается это путем добавления в культуру тканей за 2-3 часа до окончания культивирования препаратов колхицин или колцимед. На третьем этапе, используя гипотонический раствор хлорида кальция или цитрат натрия, добиваются гипотонизации клеток, в результате чего клетка набухает, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся, и хромосомы свободно плавают в цитоплазме. Далее полученная культура фиксируется смесью метанола и уксусной кислоты, центрифугируется и меняется фиксатор. Суспензия с фиксатором наносится на чистое предметное стекло, где метафазная пластинка расправляется и в ее пределах располагаются отдельно лежащие хромосомы. По мере высыхания фиксатора, клетка прочно прикрепляется к стеклу. Таким образом, независимо от культуры клеток, из которых были получены метафазные пластинки общий принцип получения препаратов следующий: накопление метафаз, гипотонизация, фиксация, раскапывание на предметное стекло.
Окраска препарата. Окраска препаратов является следующей стадией после получения метафазных пластин и делится на простые, дифференцированные и флюоресцентные. Каждая из видов окрашивания применяется для выявления только определенных изменений кариотипа. При простой окраске (метод окраски по Гимзе), возможно лишь групповая идентификация хромосом, поэтому данный метод используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа. Простая окраска широко применяется для изучения хромосомного мутагенеза при проверке факторов окружающей среды на мутантность. Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине, контурируя при этом центромеру, спутники и вторичные перетяжки. Дифференциальное окрашивание обусловлено способностью к избирательному окрашиванию по длине и обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающееся в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (темные и светлые), которые специфичны для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района. Наиболее часто используется G-окраска. При этом хромосомы предварительно обрабатываются протеазой или солевым раствором. Для изучения мутационного процесса у человека широко используется метод дифференциальной окраски сестринских хроматид, основанный на способности включатся в последовательность репликации хромосомы аналога тимидина-5-бромдезоксиуридина. Участки хромосомы, включившие этот аналог, окрашиваются плохо, поэтому используя этот метод можно идентифицировать любую хромосому или хромосомную перестройку.
Исследование полового хроматина. Метод определения полового хроматина быстрее и проще, чем исследование набора хромосом (кариотипа), поэтому он применяется в качестве одного из скрининг-тестов при массовых обследованиях населения. В норме в клетках женского организма при определенных способах окраски вблизи ядерной мембраны образуется интенсивно окрашиваемое тельце - половой хроматин, или тельце Барра, которое образуется одной, неактивной Х-хромосомой. Другая Х-хромосома в клетках женского организма является активной. У мужчин имеется лишь одна Х-хромосома, и она всегда активна, поэтому в ядрах клеток мужского организма половой хроматин не определяется. Для исследования полового хроматина Х обычно берут соскоб со слизистой полости рта. Наиболее распространен экспресс-метод окраски по Сандерсу с использованием 2% раствора уксуснокислого ацетоорсеина с последующей иммерсионной микроскопией. Кроме того, в зрелых нейтрофилах крови выявляется еще и так называемая барабанная палочка, причем телец хроматина и барабанных палочек на единицу меньше числа Х-хромосом. В нейтрофилах у мужчин выявляются также околоядерные образования в виде «ниточек» и «волосков». Исчезновение у женщин неактивной Х-хромосомы ведет к отсутствию полового хроматина. Появление у мужчины дополнительной Х-хромосомы приводит к формированию тельца полового хроматина.
Показания для цитогенетического обследования больного:
- 1) множественные пороки развития (с вовлечением трех и более систем); наиболее постоянные нарушения - пороки рзвития головного мозга, опорно-двигательной системы, сердца и мочеполовой системы;
- 2) умственная отсталость в сочетании с нарушениями физического развития, дисплазиями, гипогенитализмом;
- 3) стойкое первичное бесплодие у мужчин и у женщин при исключении гинекологической и урологической патологии;
- 4) привычное невынашивание беременности, особенно на ранних стадиях;
- 5) нарушение полового развития (гипогонадизм, половые инверсии);
- 6) небольшая масса ребенка, рожденного при доношенной беременности.
Применение цитогенетического метода в клинической генетике обусловило развитие нового направления - клинической цитогенетики, которая позволяет:
- - установить происхождение структурно перестроенных хромосом и их точную классификацию;
- - выделить синдромы, обусловленные дисбалансом по участкам индивидуальных хромосом;
- - накапливать сведения об изменениях хромосом в опухолевых клетках, у больных с наследственными заболеваниями крови и т.д.
Цитогенетический метод изучения наследственности человека представляет собой микроскопический анализ хромосом. Он стал широко применяться с начала 20-х годов 20-го столетия. С помощью метода осуществляется исследование морфологии человеческих хромосом и их подсчет. Его также используют для культивирования лейкоцитов, чтобы получить метафазные пластинки. Далее рассмотрим подробнее, что собой представляет цитогенетический метод изучения наследственности человека.
Общие сведения
Цитогенетический метод исследования генетики человека, его развитие и становление связаны с такими учеными, как Леван и Тио. Они в 1956 году первыми установили точное количество хромосом у людей. Их оказалось не 48, как думали ранее, а 46. Именно это и положило начало исследованию мейотических и митотических хромосом человека. В 1959-м году французскими учеными Готье, Тюрпеном и Леженом была установлена природа синдрома Дауна. Используя цитогенетический метод, они выявили, что болезнь имеет хромосомную этиологию. В последующие годы было описано еще множество патологий, часто встречающихся у людей и имеющих ту же природу. Сегодня цитогенетический метод изучения наследственности используется при диагностировании, составлении хромосомных карт, анализа мутационного процесса и решения прочих важных проблем. В 1960 году в США была разработана 1 Международная классификация. В основе нее использовались размеры хромосом, а также расположение центромеры - первичной перетяжки.
Анализ кариотипа
Оценка и выявление аномалий проводится в несколько приемов. Для выполнения анализа необходим фрагмент периферической крови больного объемом около 1-2 литров. Этапы цитогенетического метода при анализе кариотипа следующие:
- Культивирование лимфоцитов.
- Окраска.
- Микроскопический анализ.
Культивирование лимфоцитов
Эта процедура необходима для стимулирования их деления. Это связано с тем, что возможности цитогенетического метода напрямую зависят от количества клеток, которые находятся на стадии метафазы, в тот момент когда хромосомы собраны наиболее компактно. Длительность культивирования, как правило, 72 часа. Увеличению числа метафазных клеток способствует введение в завершении процесса колхицина. Он приостанавливает на стадии метафазы деление, разрушает его веретено и повышает конденсацию хромосом. Затем клетки перемещаются в гипотонический раствор. Он провоцирует разрыв ядерной оболочки и свободное движение хромосом в цитоплазме.
Окрашивание
На этой стадии процесса клетки фиксируются с помощью уксусной к-ты и этанола в пропорции 1:3. Далее суспензию помещают на предметные стекла и сушат. В соответствии с целями анализа применяются разные приемы дифференциального окрашивания. Длительность процедуры - несколько минут. Окрашивание приводит к возникновению рисунка с поперечной исчерченностью, специфичного для каждой из хромосом.
Микроскопический анализ
Самым трудоемким процессом считается световое микроскопирование. Для его выполнения необходима высокая квалификация специалиста. Чтобы выявить хромосомные аномалии, следует проанализировать не меньше 30-ти пластинок. Весьма результативными считаются компьютерные методы исследования.
Разрешающая способность
Молекулярно-цитогенетический метод может применяться для анализа хромосом, отдельные сегменты которых могут иметь разную окраску. При этом кариотипы в целом похожи на красочные фантастические удивительные картины. Внедрены и активно применяются методы, с помощью которых осуществляется окрашивание хромосом в состоянии покоя, когда они максимально растянуты. Использование таких приемов позволяет идентифицировать сегменты, размер которых порядка 50 килобаз.
Развитие отрасли
В течение последних нескольких лет отмечается достаточно активный сдвиг в становлении области молекулярной биологии. Это прежде всего обуславливается работами по расшифровке генома людей, выполненными в рамках государственных и международных программ "Совокупность человеческих генов". В результате трудов были не только получены обширные по своему объему сведения по строению дезоксирибонуклеиновой кислоты. Были также проведены исследования современных технологий анализа, способов обработки больших объемов информации, созданы и сохранены информационные базы данных. На основании этих материалов сформировалось новое направление - молекулярная генетика. Она позволила обнаружить многочисленные специфичности в функциях хромосомного набора. Цитогенетический метод изучения используется для выявления новых элементов и звеньев, осуществления дешифровки мутации при наличии солидного числа врожденных заболеваний.
Специализированные области
Как видно, цитогенетический метод позволил решить существенные проблемы. В связи с этим стали появляться специализированные направления. В частности, сформировались такие области, как функциональная молекулярная генетика, врачебная, этническая геномика (этногеномика), сравнительная наука, исследующая гены и геномы живых существ и прочие.
Этногеномика
Основной ее задачей является анализ генетического многообразия в разнообразии генов отдельных территориальных общностей, наций, групп. В данном случае необходимо подчеркнуть принципиально важную идею. Благодаря этногеномике генетическая хромосомная механика стала влиять не только на имеющие определенное родство виды науки о терапии и жизнедеятельности, но и на достаточно отчужденные области, как, например, история.
Вариабельность
В процессе декодирования хромосомного набора, в то время как уже выявлены главные особенности в его конструкции, ученым стала ясна серьезность многообразия генома. Анализ вариабельности позволяет решить разнообразные проблемы, как практического, так и теоретического характера. Особое значение цитогенетический метод имеет при оценке развития человечества, принимая во внимание происхождение, цикл перемещения, формирование, родство и взаимодействие разных видов.
Анализ ДНК
Исследования дезоксирибонуклеиновой кислоты людей, населяющих планету сегодня, позволяют получить информацию о достаточно отдаленных явлениях и хронологических фактах, даже до самого момента появления человека. Так, к примеру, было выявлено, что в дезоксирибонуклеиновой кислоте вписано множество событий. Чтобы интерпретировать результаты этих исследований, необходимо рассматривать ДНК разных представителей всех общин, определяя степень и хромосомного родства.
Патологии
Причины многих заболеваний, к примеру, синдром Шерешевского-Тернера, Клайнфельтера, Дауна и прочих, долгое время оставались невыясненными. Но использование цитологического метода позволило обнаружить аномалии хромосом. Мужчины, страдающие синдромом Клайнфельтера, отличаются недоразвитостью гонад, умственной отсталостью, дегенерацией семенных канальцев, непропорциональностью конечностей и прочим. У женщин диагностируется болезнь Шерешевского-Тернера. Синдром проявляется в отсутствии менструаций и позднем половом созревании, недоразвитости гонад, небольшом росте, бесплодии и прочих признаках. В результате исследований было выявлено нерасхождение половых хромосом в процессе формирования родительских гамет. Дальнейший анализ показал, что следствием этого являются различные аномалии. Отмечается, в частности, полисомия. Например, мужчины могут иметь набор XX Y, XXX Y, ХХХХ Y, женщины же - XXX, ХХХХ. Существует особенность значения половых хромосом при детерминации человеческого пола при их нерасхождении. Так, в отличие от дрозофилы, она проявляется в том, что XX Y определяет исключительно мужской, а Х0 - женский пол. Вместе с этим увеличение количества хромосом Х при сочетании с одной Y только усиливает болезнь Клайнфельтера. Полисомия либо трисомия у женщин также является провоцирующим фактором для развития патологий, сходных с синдромом Шерешевского-Тернера.
В заключение
Патологии, спровоцированные нарушениями в нормальном количестве половых хромосом, обнаруживаются анализом хроматина. При нормальном наборе у мужчин он в клетках не обнаруживается. У здоровых женщин хроматин выявляется в виде 1 тельца. На фоне полисмии у женщин и мужчин число телец хроматина всегда меньше количества хромосом Х на единицу. Для каждой такой зиготы генетическая активность присутствует только у одного структурного элемента. Остальные же хромосомы Х в виде полового хроматина принимают гетеропикнотическое состояние. Причины данной закономерности сегодня выявлены не до конца. Тем не менее предполагается, что она обуславливается нивелированием активности генов в половых хромосомах гомо- и гетерогаметного пола. Кроме описанных выше, патологии могут возникать вследствие нерасхождения аутосом, а также благодаря разнообразным перестройкам типа делеций, транслокаций и прочих. С хромосомными аномалиями врожденного типа связано множество болезней. Именно поэтому цитогенетический метод имеет особое значение в их выявлении.
Цитогенетические исследования - это совокупность методов исследования связи между явлением наследственности и строением клеток (особенно структур клеточного ядра). Цитогенетические исследования играют важную роль в медико-биологических работах, так как с их помощью выясняют генетические особенности, изменчивость (см.), происхождение и эволюцию живых существ.
Объектом цитогенетических исследований служат в первую очередь (см.) человека, животных и растений, имеющие специфические для каждого вида свойства (количество, размеры, особенности строения) и образующие характерный для данного организма кариотип. Поэтому методы цитогенетических исследований используются при построении естественных классификаций живых организмов.
В цитогенетических исследованиях уделяют особое внимание полиплоидии - явлению, связанному с кратным увеличением числа хромосом, сопровождающимся появлением целого ряда новых свойств (увеличение общих размеров, вкусовых качеств фруктов и овощей, жизнестойкости у растений и т. д.). Разработка проблемы полиплоидии имеет практическое значение в , в селекции растений и животных.
С помощью цитогенетических исследований обнаруживают изменения в хромосомах, передающиеся потомству и определенным образом влияющие на признаки организма. Изучают вредные хромосомные перестройки, утрату, выпадение или добавление отдельных хромосом или участков хромосом. Они позволяют выявить участие наследственного фактора в возникновении ряда заболеваний человека (см. Наследственные болезни), в том числе нарушений развития, предрасположенность к злокачественным новообразованиям и т. д. Цитогенетические исследования привели к правильному пониманию природы .
С помощью цитогенетических исследований установлено, например, что в ядрах клеток различных тканей и органов, но только у самок, присутствуют интенсивно окрашиваемые специальными красителями образования, так называемые тельца Барра или (см.). Оказалось, что половой хроматин встречается у многих животных и у человека. Открытие полового хроматина позволило определять человека на клеточном уровне (это имеет особое значение для судебной медицины), диагностировать пол на ранних стадиях беременности и решать ряд других вопросов медицинской практики.
См. также Генетика, Наследственность.
Цитогенетические исследования - микроскопическое изучение особых структур клетки, обусловливающих процессы наследования и развития.
Цитогенетические исследования получают все более широкое применение в клинической медицине. Наиболее простым, быстрым и доступным методом цитогенетического анализа является исследование полового хроматина.
Половой хроматин представляет собой хроматиновое тельце, которое отсутствует у особей мужского пола, а у особей женского пола прилежит к ядерной оболочке.
Таким образом, это тельце может служить цитологическим признаком пола, в связи с чем оно и получило название половой хроматин.
Размеры телец полового хроматина у человека колеблются от 0,7 до 1,2 мк, форма их может варьировать (рис. 1 - 3). У женщин половой хроматин определяется в среднем в 40% ядер (рис. 4). Он образуется одной из Х-хромосом женского кариотипа, находящейся в неактивном, спирализованном состоянии. Половой хроматин можно определить в клетках слизистой оболочки полости рта, влагалища и мочеиспускательного канала, а также в клетках крови, биопсированной кожи, культивируемой ткани взрослого, в эмбриональной ткани, нервных клетках.
Наиболее простая и удобная методика определения полового хроматина в клетках слизистой оболочки полости рта предложена Тири (Н. Thiries) и усовершенствована Сандерсоном (S. Sanderson). Для исследования берут соскоб со слизистой оболочки щек. Материал переносят на предметное стекло, высушивают на воздухе и в течение 10 мин. фиксируют в метиловом спирте. Окраску производят каплей свежефильтрованного ацетоорсеина (1 г синтетического орсеина растворяют в 45 мл ледяной уксусной кислоты, подогревают до кипения и после охлаждения фильтруют, к 45 мл профильтрованного раствора добавляют 55 мл дистиллированной воды и эту смесь фильтруют повторно). При микроскопировании иммерсионным объективом подсчитывают количество хроматинположительных ядер на 100 клеток.
Исследование полового хроматина применяют для цитологического определения пола, быстрой и ранней диагностики заболеваний, связанных с аберрациями половых хромосом (в частности, синдромов Клайнфелтера, Шерешевского-Тернера и др.), характеристики ряда физиологических процессов (в частности, менструального цикла), исследования общих и локальных закономерностей ряда патологических процессов и прежде всего злокачественных новообразований, выяснения действия некоторых терапевтических методов и средств (антибиотиков, кортикостероидов, цитостатических препаратов).
К методам цитогенетического анализа относится также изучение кариотипа (см.).
Установлено, что хромосомный набор человека состоит из 46 хромосом (23 пары), двух половых хромосом (XX - у женщины, XY - у мужчины), 22 пар аутосом (рис. 5) и отличается высоким постоянством в клетках человеческого организма.
В зависимости от длины хромосом и расположения их центромер весь хромосомный набор делится на 7 групп - А, В, С, D, Е, F, G.
Для изучения хромосомного набора человека (кариотипа) используют методы культивирования лейкоцитов периферической крови, фибробластов эмбриональной ткани, культивирование клеток кожи и прямой метод определения хромосомного набора в клетках костного мозга.
Впервые об успешном культивировании неделящихся лейкоцитов сообщил советский биолог Г. К. Хрущев (1935). В 1958 г. Ноуэлл (P. Nowell) предложил использовать для стимуляции деления лейкоцитов вещество, выделенное из бобовых растений,- фитогемагглютинин (ФГА). Культивирование лейкоцитов осуществляют по модифицированной и усовершенствованной методике. 10 мл венозной крови, взятой стерильно в пробирку с гепарином (1 мл ампулированного гепарина разводят в 20 раз раствором Хенкса), помещают на 30-40 мин. в холодильник. Затем стерильно (в боксе) в кровь добавляют 0,7 - 1 мл 10% раствора желатины для ускорения осаждения эритроцитов. После отстаивания крови плазму отсасывают и помещают в стерильную колбу. К плазме добавляют среду 199 либо среду Игла из расчета 1,5 мл среды на 1 мл плазмы.
Для стимуляции митотической активности лейкоцитов в смесь добавляют 0,2 мл ФГА. Полученную клеточную суспензию помещают в термостат при t° 37° на 72 часа. За 2-3 часа до проведения фиксации на каждый флакон (суспензия для культивирования разливается по 1,5-2 мл в стерильные флаконы типа пенициллиновых) добавляют по 0,5-0,75 мкг колхицина (рабочий раствор колхицина: 10 мкг на 1 мл дистиллированной воды) и продолжают культивирование. В дальнейшем культуры центрифугируют в течение 5 мин. при 800 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, к ней добавляют 3-5 мл 0,95% раствора цитрата натрия, нагретого до t°37°, который вызывает набухание клеток. В гипотоническом растворе клетки находятся от 15 до 30 мин., после чего надосадочную жидкость сливают, к осадку осторожно добавляют фиксатор (3 ч. абсолютного спирта + 1 ч. ледяной уксусной кислоты), ставят в холодильник на 15 мин., затем повторно центрифугируют и меняют фиксатор. На обезжиренные предметные стекла наносят 1-2 капли клеточной суспензии и высушивают над пламенем либо поджигают фиксатор («жженые» препараты). Препараты красят полихромной синью Унны, ацетоорсеином или по Романовскому. Хромосомный набор изучают при помощи иммерсионной микроскопии в 100 метафазных пластинах.
Для изучения хромосом используют также прямой метод определения хромосомного набора в клетках костного мозга: 1 мл свежеаспирированного пунктата костного мозга помещают в колбу с 30 мл среды 199 и 3 мл раствора колхицина (10 мкг на 1 мл). Содержимое колбы осторожно взбалтывают для равномерного распределения клеток, а затем центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и к осадку добавляют 10 мл 0,95% раствора цитрата натрия, подогретого до t° 37°. Клетки тщательно ресуспензируют и помещают в термостат при t° 37° на 40-45 мин. После этого вновь проводят центрифугирование, надосадочную жидкость сливают и к осадку добавляют свежеприготовленный фиксатор, состоящий из 3 ч. метилового спирта и 1 ч. концентрированной уксусной кислоты. Через 10 мин. осадок ресуспензируют и оставляют в фиксаторе еще на 20 мин. при комнатной температуре, затем центрифугируют в течение 10 мин., вновь меняют фиксатор и приготовляют препараты тем же способом, как при фиксации культуры лейкоцитов крови.
Исследование кариотипа может быть с успехом использовано для диагностики хромосомных заболеваний человека. За последнее время выделена целая группа хромосомных болезней, связанных с патологией как половых, так и аутосомных хромосом (см. Наследственные болезни). Помимо изменения количества хромосом, возможно нарушение их морфологии. Так, при хроническом миелоидном лейкозе наблюдается необычно малая акроцентрическая хромосома из 21-й пары. Появление анеуплоидии (увеличение или уменьшение числа хромосом, некратное гаплоидному числу хромосом) может служить прогностическим тестом для терминальной стадии лейкоза.
Цитогенетические исследования все ближе смыкаются с онкологическими. Возможно, что изменения хромосомного набора при раковых процессах можно будет использовать для их ранней диагностики. Для цитогенетических исследований используют методы кратковременных тканевых культур: метод плазменного сгустка с последующим исследованием субкультур и метод первично трипсинизированных суспензионных культур. Предпочтение следует отдать первому методу, так как второй требует большого количества ткани для получения суспензии клеток, способных к размножению.
Для создания наиболее благоприятных условий метаболизма используют плацентарную сыворотку человека, не обладающую токсичностью, 50% эмбриональный экстракт абортированных плодов человека, который готовят на среде Игла. Для закрепления кусочков на стекле и прикрепления большего числа клеток при применении суспензионных культур используют сухую человеческую плазму IV группы, разведенную перед употреблением средой Игла и плацентарной сывороткой 1:1; после внесения эксплантата добавляют эмбриональный экстракт. Культивирование проводят во флаконах Карреля (см. Культура тканей).
Рис. 1. Половой хроматин в виде овала (Х1100).
Рис. 2. Половой хроматин в виде треугольника (XI100).
Рис. 3. Половой хроматин в виде утолщения ядерной оболочки (Х1100).
Рис. 4. Хроматинотрицательное ядро у женщины (Х1100).
Рис. 5. Нормальный женский кариотип (x1100).
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА
Цитогенетический метод, его значение
Цитогенетический анализ позволяет записывать диагноз наследственного заболевания в виде каріотипічної формулы.
Цитогенетический метод (метод хромосомного анализа) основывается на микроскопическом исследовании структуры и количества хромосом. Он получил широкое применение в 20-е годы XX века, когда были получены первые сведения о количестве хромосом у человека. В 30-х годах были идентифицированы первые 10 пар хромосом.
В 1956 г. шведские ученые Дж. Тийо и А. Леван впервые доказали, что у человека 46 хромосом.
Цитогенетический метод используют для:
Изучение кариотипов организмов;
Уточнение числа хромосомных наборов, количества и морфологии хромосом для диагностики хромосомных болезней;
Составление карт хромосом;
Для изучения геномного и хромосомного мутационного процесса;
Изучение хромосомного полиморфизма в человеческих популяциях.
Хромосомный набор человека содержит большое количество хромосом, основные сведения о которых можно получить при изучении их в метафазе митоза и профазе - метафазе мейоза. Клетки человека для прямого хромосомного анализа получают путем пункции костного мозга и биопсии гонад, или косвенным методом - путем культивирования клеток периферической крови (лимфоциты), когда получают значительное количество метафаз. Косвенным методом исследуют также клетки амниотической жидкости или фибробласты, полученные при амніоцентезі или биопсии хориона, клетки абортусів, мертворожденных и др.
Чаще исследуют хромосомы в лимфоцитах периферической гепаринізованої крови. Для стимуляции митоза добавляют фитогемагглютинин, а для остановки митоза - колхицин. Препарат окрашивают ядерными красителями: 2 % раствором ацеторсеїну, азуреозином, красителем Унна, раствором Гимза и др. Накрывают покровным стеклышком, удаляют избыток красителя фильтровальной бумагой, рассматривают под микроскопом с масляной імерсією.
В последнее время все исследования в цитогенетиці человека проводят с применением методов дифференциального окраска хромосом, которые позволяют отличить каждую хромосомную пару. Существует несколько способов окраски: Q , G , С, R (рис. 1.42). В решении вопросов диагностики хромосомных болезней разные методы дифференциальной окраски применяют в комбинации. Благодаря дифференциальному окраске хромосом можно обнаружить незначительные хромосомные поломки: небольшие делеции, транслокаціїта др.
Получив мікропрепарат, изучают его визуально и составляют ідіограму кариотипа, то есть упорядоченное размещение каждой пары хромосом по индивидуальным признакам различий: общая длина хромосомы, форма, расположение центромеры.
Большинство хромосом по такому методу можно только отнести к определенным группам согласно Денверской классификации (см. раздел 1.2.2.12).
Этот метод позволяет диагностировать много наследственных болезней, изучать мутационный процесс, сложные перестройки и малейшие хромосомные аномалии в клетках, которые вступили в фазу деления и вне делением.
На хромосомный анализ направляются пациенты с множественными врожденными пороками развития, дети с задержкой физического и психомоторного развития, пациенты с недиференційованими формами олигофрении (слабоумия), с нарушением половой дифференцировки, женщины с нарушением менструального цикла (первичная или вторичная аменорея), семьи с бесплодием, женщины с привычным невынашиванием беременности (выкидыши, мертворожденные).
